人类基因检测相关试剂评价国家参考品研制技术要求

  根据《医疗器械监督管理条例》《体外诊断试剂注册管理办法》，“组织体外诊断试剂国家标准品、参考品的制备和标定工作”的责任主体为中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）。

  目前，中检院可以提供113种注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品，其中有8种人类基因检测相关试剂评价国家参考品。另外，中检院还正在开展如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测参考品、单倍型基因组DNA参考品、流产组织拷贝数变异检测参考品、HLA分型参考品及脆性X综合征FMR1基因突变参考品等人类基因检测相关试剂评价国家参考品的研制工作。

  为进一步规范这类体外诊断试剂标准物质的研制工作，笔者对人类基因检测相关试剂评价国家参考物质研制过程中的一般技术要求进行了梳理，供业内同仁交流探讨。

  参考物质原料选择及确证

  人类基因检测相关试剂评价国家参考物质通常由检测基因位点阳性参考品（有时也称为突变阳性参考品）、检测基因位点阴性参考品（有时也称为野生型以及其他同源基因位点阳性参考品）、检测限参考品及精密性参考品等组成，用于全面控制诊断试剂的质量。

  阳性参考品用来控制试剂的阳性符合率，由一定数量的阳性样品组成。通常是从大量样品中根据不同目的筛选出来，要求尽可能覆盖靶基因多种等位基因或突变类型，应具有代表性、满足临床样本的分布类型、地域或民族等群体遗传

  标记代表性，并经过确证。同时，还可以根据需求采用相应基因突变的永生化淋巴细胞系、基因编辑突变细胞系等。

  阴性参考品用来控制试剂的阴性符合率，由一定数量的阴性样品组成。通常来自检测靶基因野生型或其他突变类型人群样本、同源基因位点阳性人群样品和（或）易产生交叉反应的样品。为了控制试剂的非特异反应，并和阳性参考品一致，根据试剂检测样本类型，应考虑阴性参考品的基质，并逐一确证。同时，阴性参考品也可以根据需求采用特定基因野生型或相关基因突变类型明确的永生化淋巴细胞系、基因编辑突变细胞系等。

  检测限参考品通常由一份或多份经过确证的稀释阳性样品组成，用来控制试剂的检测限，即试剂所能检出的样品中阳性物质的最低限度。检测限参考品设置应根据试剂的临床预期用途进行合理设立，如临床预期用途为靶向药物指导的检测试剂，其检测限参考品设置建议和临床治疗以及临床样本中的实际分布相关联，并采用具有药效相关的浓度和比例进行设置。同时，建议设置多个梯度，主要从核酸浓度和突变所占百分比两个方面进行评价。

  精密性参考品通常由一份或几份经过确证的阳性样品组成，用来控制试剂的重复性，建议包括弱阳性、中阳性或强阳性水平的精密度验证；必要时设置阴性参考品重复性验证。

  参考物质的制备和标定

  在制备人类基因检测相关试剂评价国家参考物质时，应根据其品种要求进行配制、稀释、分装、冻存，必要时进行冻干熔封。

  通常，人类基因检测相关试剂评价国家参考物质一般采用液体冰冻的方式保存，不需要进行冻干操作。在稀释过程中，应对稀释液进行充分验证。稀释液一般采用的是TE溶液、去核酸酶水以及野生型基因组DNA溶液、处理后的临床样本等。稀释液的选择应保证不干扰后续检测、有助于更好地模拟临床样本，并不对参考品的浓度定量和/或比例确定造成干扰。

  而冻干一般需加保护剂等物质，该类物质应对参考物质的特性量值、稳定性和试验操作过程无影响，并且其本身在干燥时不挥发。需要干燥保存的，应在分装后立即进行冻干和熔封。冻干的水分含量应不高于3.0％。整个分装、冻干和熔封过程，应保证对各安瓿间主要指标和稳定性的一致性不产生影响。

  在对人类基因检测相关试剂评价国家参考物质进行标定时，应首先确定是否有国际标准品或参考品，如果有，以其作为标准标定待制备的参考物质；如果没有，则依据相关标准、指南、规范或其他经过验证的方法来制定该参考物质的定值方案和方法。为保证新研制参考品的适用性，在选择参与协作标定的试剂盒时，应注意其技术原理、试剂盒生产企业的代表性及覆盖面，以确定其在实际工作中的适用情况。

  人类基因检测相关试剂评价国家参考物质主要控制的指标有阴阳性符合率、检测限及重复性等，不同类型的人类基因检测相关试剂评价国家参考物质，对这些指标的考核标准也不尽相同，应依据各种人类基因检测相关试剂的特点建

  立其相应的考核标准。

  参考物质的稳定性研究

  人类基因检测相关试剂评价国家参考物质稳定性研究可采用适宜方式进行，如经验资料或进行加速破坏试验。进行加速破坏试验时，一般根据制品性质放置不同温度、不同时间来测定考核指标，以评估其稳定性。

  参考物质建立后，还应定期进行期间核查，观察其稳定性；同时，还应对其反复冻融稳定性进行考察。根据国际惯例，目前人类基因检测相关试剂评价国家参考物质不设“有效期”，由中检院对标准物质进行定期监测。

  负责人类基因检测相关试剂评价国家参考物质研制工作的实验室在工作完成后，还要经过严格的审评审批，获得签批的标准品应进行贴标签及外包装工作，标签内容一般包括中文名称、批号及标识量，超出规定用途时，使用者应对标准物质的适用性负责。

  该类标准物质的贮存条件应有利于基因特性的稳定，通常为低温冷冻保存，对贮存情况应定期检查并记录。对于某些有特殊贮存要求的，应有特殊的贮存措施，并应在标签与使用说明书中注明。

  人类基因检测相关试剂评价国家参考物质应有专人负责保管和发放，由中检院直接提供给各生产单位标定其工作参考品或用于产品检定。